Nueva técnica de seguimiento de las infecciones virales, promueve el desarrollo de medicamentos antivirales


Los científicos del Centro Laboratorio de Investigación Naval de Bio-Molecular Ciencia e Ingeniería han desarrollado un método para detectar la presencia del virus en las células y estudiar su crecimiento. Dirigidas a un virus que tiene ácido ribonucleico (RNA) como su composición genética, la nueva técnica llamada de ácido nucleico bloqueado (LNA) citometría de flujo de fluorescencia de hibridación in situ (FISH-flujo), implica la unión de una sonda de LNA de ARN viral.

Si bien las partes individuales de la técnica se han desarrollado anteriormente, los Dres. Kelly Robertson y Eddie Chang, en colaboración con investigadores del Laboratorio Nacional de Laboratorio de Referencia para Biosensores y Biomateriales, demuestran por primera vez que la combinación de sondas LNA con flujo-FISH se puede usar para cuantificar el ARN viral en las células infectadas. Esto también permite a los científicos monitorear los cambios en el tratamiento de drogas antivirales acompaña ARN viral.

Una vez que la sonda está unida al ARN viral en las células de mamífero, se marca con un colorante fluorescente, a continuación, miles de estas células marcadas se miden fácilmente por "citometría de flujo" - un método para el recuento y el examen de partículas microscópicas, tales como células y cromosomas, su suspensión en un flujo de fluido y que pasan de un aparato de detección electrónica.




"La capacidad de medir rápidamente miles de células para detectar la presencia del virus, esta técnica proporciona los métodos que actualmente se utilizan para controlar la replicación viral", dijo Robertson.

Tradicionalmente, los anticuerpos se utilizan para detectar los virus deben ser producidos y calibrado para cada cepa específica y son altamente susceptibles a mutaciones virales. Los ensayos comúnmente utilizados para cuantificar las cargas virales y para el desarrollo de fármacos pueden llevar mucho tiempo y se basan en signos visibles de daños en las células, que no se produce en todos los virus y pueden requerir largos períodos de tiempo en producirse.

Técnicas tales como la reacción en cadena inversa cuantitativa transcripción de la polimerasa (qRT-PCR), microarrays, y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), mientras que muy sensible, implican la lisis [pausa] de las células antes de la medición y por lo tanto son capaces para proporcionar información sobre la viabilidad celular, fenotipos de células infectadas, el porcentaje de células infectadas o de la variación de la infección en una población de células. La sonda de LNA difiere de sondas de nucleótidos tradicionales mediante la unión más estrechamente a su ARN diana.

LNA flujo-FISH presenta una forma rápida y simple para la detección de compuestos con actividad antiviral y podría ser adaptado para controlar la infección en la sangre para la terapia y desarrollo de vacunas. Este método agrega una herramienta indispensable para varias áreas emergentes de la biología celular que permite el uso de mediciones de alto rendimiento para toda la población y mejora el análisis estadístico.

"Este método puede ser ampliado con la adición de más de un tipo de sonda de LNA para permitir la detección de más de varios ARN virales y del huésped", añade Robertson. "La multiplexación mejora se puede utilizar para comprender mejor los agentes infecciosos, permitiendo esta técnica para ser utilizada para ayudar en el desarrollo de fármacos antivirales para una variedad de virus."

LNA flujo-FISH ofrece una ventaja sobre otras técnicas debido a su simplicidad y superioridad. Los métodos que implican la recombinación genética del virus para expresar una proteína fluorescente como un medio para marcar la presencia del virus puede utilizar la citometría de flujo para el análisis de gran lote de células infectadas. Sin embargo, una excepción a este enfoque es cepas virales que no han adquirido mutaciones genéticas, conocidos como virus de tipo salvaje (tales como cepas de virus de inmunodeficiencia humana VIH), lo que requeriría una gran inversión inicial de mano de obra para la ingeniería de cada virus de interés.

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